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小鼠外部激化、胎体养护和胎体迅捷冷化的研讨

2012-11-22 08:10:37中国农业招标网

  小鼠胚胎快速冷冻的研究使用PMSG与hCG进行超排处理,方法同实验一,分别在注射hCG后7677h和9092h采集桑椹胚和早期囊胚。胚胎冷冻参照寺西<5>的方法加以改进。基础液为mD-PBS,冷冻液为PBS+20%FCS+2.0M甘油+0.5M蔗糖。胚胎装管后室温平衡10min,然后置于距液氮面5cm高处熏蒸冷冻。约2min后,投入液氮中。冷冻胚胎在37水浴中解冻,移入添加10%FCS的TCM-199中培养,鉴定冷冻胚胎存活的标准是桑椹胚发育至囊胚。早期囊胚发育至扩张囊胚。

  小鼠胚胎体内发育与运行规律的研究运用超数排卵技术,对小鼠的超排处理和胚胎体内发育与运行规律进行了研究。建立了高效的超排程序,每只鼠可获胚胎3040枚,可用胚胎2030枚。研究明:注射hCG后1220h受精卵发育至原核期,4248h为2细胞期,4860h为4细胞期,6068h为8细胞期,以上各期受精卵均处于输卵管中;7578h为桑椹胚,7880h为致密桑椹胚,9092h为早期囊胚,9296h为囊胚,以上各期均处于子宫角中。

  小鼠卵母细胞的体外成熟与受精研究了成熟培养液(TYH)中添加FSH、hCG及胎牛血清(FCS)对小鼠卵母细胞体外成熟,受精及发育的影响。结果明,激素和胎牛血清的添加对小鼠卵母细胞的体外成熟率无显著影响。添加激素组卵母细胞的体外受精率极显著高于TYH组(P<0.01),而添加FCS组及添加FCS和激素组的体外受精率又极显著高于单独添加激素组(P<0.01)。FCS的添加还能极显著提高各个阶段的胚胎发育率(P<0.01)。FSH和hCG之间无显著的效果差异。激素和FCS之间也没有显著的协同效应。与体内成熟卵母细胞相比,体外成熟卵母细胞的受精率及发育率都显著降低(3,4)。

  小鼠胚胎快速冷冻的研究以D-PBS+甘油+蔗糖为冷冻液,以D-PBS+蔗糖为稀释液,共对12批400枚胚胎进行了冷冻,结果桑椹胚冷冻解冻后的存活率为69.3%,早期囊胚冷冻解冻后的存活率为60.4%.二者之间无明显差异。经X2检验,桑椹胚和囊胚冷冻后的存活率无显著差异(P>0.05)。

  小鼠体外受精卵的发育与运行规律目前在小鼠的体外受精、孤雌生殖及核移植等研究领域需要大量的成熟卵母细胞。小野等(1988)<1>报道,在hCG注射后1718h,成熟卵母细胞位于输卵管膨大部;而牛岛等(1989)<6>却报道系在hCG注射后1214h.本研究结果明,虽然在hCG注射后12h即可在输卵管膨大部发现卵母细胞团,但以hCG注射后1418h获得的卵母细胞数量最多。因此建议在hCG注射后1418h内由输卵管膨大部采集卵母细胞。

  需要特别指出的是,在超数排卵情况下,由于排卵的不整齐性,致使受精卵的发育也出现一定程度的不整齐性。小鼠卵母细胞的体外成熟与受精在体内,卵母细胞需经过一系列生理生化变化才能成熟,在体外条件下,卵母细胞核在培养液中能够恢复减数分裂<7>,但胞质成熟十分困难,进而影响到体外受精率与胚胎发育。

  据报道,胚胎阶段对冷冻效果具有明显的作用,桑椹胚和早期囊胚比进一步发育的囊胚存活率高。本研究对桑椹胚进行冷冻的结果明,二者在冷冻解冻后的存活率上没有显著差异(P>0.05),但桑椹胚的存活率要高于早期囊胚(69.3%60.4%),说明在桑椹胚阶段冷冻效果较好。

  

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